Produkter
Lifecosm SARS-Cov-2-RT-PCR-detektionskit til 2019-nCoV
Forventet brug
Dette sæt bruges til kvalitativ påvisning af ny coronavirus (2019-nCoV) ved hjælp af svælgpodninger, nasopharyngeale podninger, bronchoalveolær skyllevæske, sputum. Påvisningsresultatet af dette produkt er kun til klinisk reference, og det bør ikke bruges som det eneste evidens for klinisk diagnose og behandling.En omfattende analyse af tilstanden anbefales i kombination med patientens kliniske manifestationer og andre laboratorieundersøgelser.
Inspektionsprincip
Sættet er baseret på et-trins RT-PCR-teknologi.Faktisk blev de 2019 nye coronavirus (2019-nCoV) ORF1ab og N gener udvalgt som amplifikationsmålregionerne.Specifikke primere og fluorescerende prober (N-genprober er mærket med FAM og ORF1ab-prober er mærket med HEX) er designet til at detektere 2019 ny type coronavirus RNA i prøver.Sættet indeholder også et endogent intern kontroldetektionssystem (intern kontrolgenprobe mærket med CY5) til at overvåge processen med prøveindsamling, RNA- og PCR-amplifikation og derved reducere falsk negative resultater.
Hovedkomponenter
| Komponenter | Bind(48T/sæt） |
| RT-PCR reaktionsopløsning | 96 µl |
| nCOV-primer TaqMan-probeblanding (ORF1ab, N-gen, RNAseP-gen) | 864 µl |
| Negativ kontrol | 1500 µl |
| nCOV positiv kontrol（l ORF1ab N-gen） | 1500 µl |
Egne reagenser: RNA-ekstraktions- eller oprensningsreagenser.Negativ/positiv kontrol: Den positive kontrol er RNA, der indeholder målfragmentet, mens den negative kontrol er nukleinsyrefrit vand.Under brug bør de deltage i udvindingen og bør betragtes som smittefarlige.De skal håndteres og bortskaffes i overensstemmelse med relevante regler.
Det interne referencegen er det humane RNAseP-gen.
Opbevaringsbetingelser og udløbsdato
-20±5 ℃, undgå gentagen frysning og optøning mere end 5 gange, gyldig i 6 måneder.
Gældende instrument
Med FAM / HEX / CY5 og andet multi-kanal fluorescerende PCR instrument.
Prøvekrav
1. Anvendelige prøvetyper: svælgpodninger, nasopharyngeale podninger, bronkoalveolær skyllevæske, opspyt.
2. Prøveindsamling (aseptisk teknik)
Svælgpodning: Tør mandlerne og den bagerste svælgvæg med to podninger på samme tid, og nedsænk derefter podepinden i et reagensglas indeholdende prøveopløsningen
Sputum: Når patienten har en dyb hoste, samles det hostede sputum i et reagensglas med skruelåg, der indeholder prøveopløsningen;bronkoalveolær skyllevæske: Prøveudtagning foretaget af læger.3.Opbevaring og transport af prøver
Prøver til virusisolering og RNA-testning bør testes så hurtigt som muligt.Prøver, der kan detekteres inden for 24 timer, kan opbevares ved 4 ℃;dem, der ikke kan opdages inden for 24
timer skal opbevares ved -70 ℃ eller derunder (hvis der ikke er nogen opbevaringsforhold på -70 ℃, skal de
midlertidigt opbevaret ved -20℃køleskab).Prøver bør undgå gentagen frysning og optøning under transport.Prøver skal sendes til laboratoriet så hurtigt som muligt efter indsamling.Hvis prøver skal transporteres over lange afstande, anbefales tøris opbevaring.
Testmetoder
1 Prøvebehandling og RNA-ekstraktion (prøvebehandlingsområde)
Det anbefales at tage 200μl væskeprøve til RNA-ekstraktion.For relaterede ekstraktionstrin henvises til instruktionerne til kommercielle RNA-ekstraktionssæt.Både det negative og det negative
kontroller i dette sæt var involveret i ekstraktionen.
2 PCR-reagensforberedelse (reagensforberedelsesområde)
2.1 Fjern alle komponenter fra sættet og optø og bland ved stuetemperatur.Centrifuger ved 8.000 rpm i et par sekunder før brug;beregn den nødvendige mængde reagenser, og reaktionssystemet er forberedt som vist i følgende tabel:
| Komponenter | N portion (25 µl system) |
| nCOV primer TaqMan probeblanding | 18 µl × N |
| RT-PCR reaktionsopløsning | 2 µl × N |
| *N = antal testede prøver + 1 (negativ kontrol) + 1 (nCOVpositiv kontrol) | |
2.2 Efter grundig blanding af komponenterne, centrifuger i kort tid for at lade al væsken på rørvæggen falde til bunden af røret, og alikvoter derefter 20 µl amplifikationssystemet i PCR-røret.
3 Prøveudtagning (prøveforberedelsesområde)
Tilsæt 5μl af de negative og positive kontroller efter ekstraktion.RNA'et fra prøven, der skal testes, tilsættes til PCR-reaktionsrøret.
Luk røret tæt og centrifuger ved 8.000 rpm i et par sekunder, før det overføres til amplifikationsdetektionsområdet.
4 PCR-amplifikation (amplificeret detektionsområde)
4.1 Anbring reaktionsrøret i instrumentets prøvecelle, og indstil parametrene som følger:
| scene | Cyklus nummer | Temperatur(°C) | Tid | kollektionwebsted |
| Baglænstransskription | 1 | 42 | 10 min | - |
| Præ-denatureringn | 1 | 95 | 1 min | - |
| Cyklus | 45 | 95 | 15 sek | - |
| 60 | 30'erne | dataindsamling |
Valg af instrumentdetektionskanal: Vælg FAM、HEX、CY5-kanalen til fluorescenssignalet.For reference fluorescerende INGEN, vælg venligst ikke ROX.
5 Resultatanalyse (Se venligst de eksperimentelle instruktioner for hvert instrument for indstilling)
Gem resultaterne efter reaktionen.Efter analyse skal du justere startværdien, slutværdien og tærskelværdien for basislinjen i henhold til billedet (brugeren kan justere i henhold til den faktiske situation, startværdien kan indstilles til 3~15, slutværdien kan indstilles til 5~20, justering) i den logaritmiske graf Ved vinduets tærskel er tærskellinjen i den logaritmiske fase, og forstærkningskurven for den negative kontrol er en lige linje eller under tærskellinjen).
6 Kvalifikationskontrol（En procedurekontrol er inkluderet i testen） Negativ kontrol: Ingen åbenlys amplifikationskurve for FAM, HEX, CY5 detektionskanalern
COV positiv kontrol: tydelig amplifikationskurve for FAM- og HEX-detektionskanaler, Ct-værdi ≤32, men ingen amplifikationskurve for CY5-kanal;
Ovenstående krav skal opfyldes samtidigt i samme forsøg;ellers er eksperimentet ugyldigt og skal gentages.
7 Bestemmelse af resultater.
7.1 Hvis der ikke er nogen amplifikationskurve eller Ct-værdi > 40 i FAM- og HEX-kanalerne i testprøven, og der er en amplifikationskurve i CY5-kanalen, kan det vurderes, at der ikke er nogen 2019 ny coronavirus (2019-nCoV) RNA i prøven;
.2 Hvis testprøven har tydelige amplifikationskurver i FAM- og HEX-kanalerne, og Ct-værdien er ≤40, kan det vurderes, at prøven er positiv for den 2019 nye coronavirus (2019-nCoV).
7.3 Hvis testprøven kun har en klar amplifikationskurve i én kanal af FAM eller HEX, og Ct-værdien er ≤40, og der ikke er nogen amplifikationskurve i den anden kanal, skal resultaterne testes igen.Hvis gentestresultaterne er konsistente, kan prøven vurderes til at være positiv for den nye
coronavirus 2019 (2019-nCoV).Hvis gentestresultatet er negativt, kan det vurderes, at prøven er negativ for 2019 ny coronavirus (2019-nCoV).
Positiv bedømmelsesværdi
ROC-kurvemetoden bruges til at bestemme sættets reference-CT-værdi, og den interne kontrolreferenceværdi er 40.
Fortolkning af testresultater
1. Hvert eksperiment skal testes for negative og positive kontroller.Testresultater kan kun bestemmes, når kontroller opfylder kvalitetskontrolkrav
2.Når FAM- og HEX-detektionskanalerne er positive, kan resultatet fra CY5-kanalen (intern kontrolkanal) være negativt på grund af systemkonkurrence.
3.Når det interne kontrolresultat er negativt, hvis reagensglassets FAM- og HEX-detektionskanaler også er negative, betyder det, at systemet er deaktiveret, eller funktionen er forkert, t testen er ugyldig.Derfor skal prøverne testes igen.
