Produkter
Lifecosm SARS-Cov-2-RT-PCR detektionskit til 2019-nCoV
Forventet brug
Dette kit bruges til kvalitativ påvisning af ny coronavirus (2019-nCoV) ved hjælp af halspodninger, nasofaryngeale podninger, bronkoalveolær skyllevæske og sputum. Detektionsresultatet af dette produkt er kun til klinisk reference og bør ikke bruges som det eneste bevis for klinisk diagnose og behandling. En omfattende analyse af tilstanden anbefales i kombination med patientens kliniske manifestationer og andre laboratorietests.
Inspektionsprincippet
Kittet er baseret på et-trins RT-PCR-teknologi. Faktisk blev ORF1ab- og N-generne for den nye coronavirus 2019 (2019-nCoV) udvalgt som amplifikationsmålområder. Specifikke primere og fluorescerende prober (N-genprober er mærket med FAM, og ORF1ab-prober er mærket med HEX) er designet til at detektere RNA for den nye type coronavirus 2019 i prøver. Kittet indeholder også et endogent internt kontroldetektionssystem (intern kontrolgenprobe mærket med CY5) til at overvåge processen med prøveindsamling, RNA og PCR-amplifikation og derved reducere falsk negative resultater.
Hovedkomponenter
| Komponenter | Bind(48T/Sæt） |
| RT-PCR-reaktionsopløsning | 96µl |
| nCOV primer TaqMan probeblanding (ORF1ab, N-gen, RNAseP-gen) | 864µl |
| Negativ kontrol | 1500µl |
| nCOV positiv kontrol（l ORF1ab N-gen） | 1500µl |
Egne reagenser: RNA-ekstraktions- eller oprensningsreagenser. Negativ/positiv kontrol: Den positive kontrol er RNA, der indeholder målfragmentet, mens den negative kontrol er nukleinsyrefrit vand. Under brug skal de deltage i ekstraktionen og bør betragtes som smittefarlige. De skal håndteres og bortskaffes i overensstemmelse med relevante regler.
Det interne referencegen er det humane RnaseP-gen.
Opbevaringsbetingelser og udløbsdato
-20 ± 5 ℃, undgå gentagen frysning og optøning mere end 5 gange, gyldig i 6 måneder.
Gældende instrument
Med FAM / HEX / CY5 og andre multikanals fluorescerende PCR-instrumenter.
Krav til prøven
1. Anvendelige prøvetyper: halspodninger, nasofaryngeale podninger, bronkoalveolær skyllevæske, sputum.
2. Prøveindsamling (aseptisk teknik)
Svælgpodning: Tør mandlerne og den bageste svælgvæg af med to podninger på samme tid, og nedsænk derefter podningshovedet i et reagensglas med prøveopløsningen.
Sputum: Når patienten har en dyb hoste, opsamles det hostede sputum i et reagensglas med skruelåg, der indeholder prøveopløsningen; bronkoalveolær skyllevæske: Prøveudtagning af læger. 3. Opbevaring og transport af prøver
Prøver til virusisolering og RNA-testning bør testes hurtigst muligt. Prøver, der kan detekteres inden for 24 timer, kan opbevares ved 4 ℃; dem, der ikke kan detekteres inden for 24
timer bør opbevares ved -70℃ eller derunder (hvis der ikke er nogen opbevaringsforhold på -70℃, bør de
midlertidig opbevaring ved -20℃ i køleskab). Prøver bør undgå gentagen frysning og optøning under transport. Prøver bør sendes til laboratoriet hurtigst muligt efter indsamling. Hvis prøver skal transporteres over lange afstande, anbefales opbevaring af tøris.
Testmetoder
1 Prøvebehandling og RNA-ekstraktion (prøvebehandlingsområde)
Det anbefales at tage 200 μl flydende prøve til RNA-ekstraktion. For relaterede ekstraktionstrin henvises til instruktionerne til kommercielle RNA-ekstraktionskit. Både negative og negative
Kontrollerne i dette kit var involveret i ekstraktionen.
2 PCR-reagensforberedelse (reagensforberedelsesområde)
2.1 Tag alle komponenter ud af kittet, og optø og bland ved stuetemperatur. Centrifuger ved 8.000 o/min i et par sekunder før brug; beregn den nødvendige mængde reagenser, og reaktionssystemet forberedes som vist i følgende tabel:
| Komponenter | N portion (25µl system) |
| nCOV primer TaqMan probeblanding | 18 µl × N |
| RT-PCR-reaktionsopløsning | 2 µl × N |
| *N = antal testede prøver + 1 (negativ kontrol) + 1 (nCOVpositiv kontrol) | |
2.2 Efter grundig blanding af komponenterne centrifugeres der kortvarigt, så al væsken på rørvæggen falder ned til bunden af røret, og derefter fordeles 20 µl amplifikationssystemet i PCR-røret.
3 Prøveudtagning (prøveforberedelsesområde)
Tilsæt 5 μl af de negative og positive kontroller efter ekstraktion. RNA'et fra den prøve, der skal testes, tilsættes PCR-reaktionsrøret.
Luk røret tæt, og centrifuger det ved 8.000 o/min i et par sekunder, før det overføres til amplifikationsdetektionsområdet.
4 PCR-amplifikation (amplificeret detektionsområde)
4.1 Placer reaktionsrøret i instrumentets prøvecelle, og indstil parametrene som følger:
| scene | Cyklus antal | Temperatur(°C) | Tid | samlingwebsted |
| Bagsidetranskription | 1 | 42 | 10 minutter | - |
| Prædenatureringn | 1 | 95 | 1 minut | - |
| Cyklus | 45 | 95 | 15'ere | - |
| 60 | 30'erne | dataindsamling |
Valg af instrumentdetektionskanal: Vælg FAM, HEX og CY5-kanalen for fluorescenssignalet. For referencefluorescens NONE, vælg venligst ikke ROX.
5 Resultatanalyse (Se venligst den eksperimentelle vejledning til hvert instrument for indstilling)
Gem resultaterne efter reaktionen. Efter analysen justeres startværdien, slutværdien og tærskelværdien for basislinjen i henhold til billedet (brugeren kan justere i henhold til den faktiske situation, startværdien kan indstilles til 3~15, slutværdien kan indstilles til 5~20, justering) i den logaritmiske graf. Ved vinduets tærskel er tærskellinjen i den logaritmiske fase, og forstærkningskurven for den negative kontrol er en ret linje eller under tærskellinjen.
6 Kvalitetskontrol (en procedurekontrol er inkluderet i testen) Negativ kontrol: Ingen tydelig amplifikationskurve for FAM-, HEX- og CY5-detektionskanaler
COV positiv kontrol: tydelig amplifikationskurve for FAM- og HEX-detektionskanaler, Ct-værdi ≤ 32, men ingen amplifikationskurve for CY5-kanal;
Ovenstående krav skal opfyldes samtidigt i det samme eksperiment; ellers er eksperimentet ugyldigt og skal gentages.
7 Bestemmelse af resultater.
7.1 Hvis der ikke er nogen amplifikationskurve eller en Ct-værdi > 40 i FAM- og HEX-kanalerne i testprøven, og der er en amplifikationskurve i CY5-kanalen, kan det vurderes, at der ikke er noget 2019 new coronavirus (2019-nCoV) RNA i prøven;
.2 Hvis testprøven har tydelige amplifikationskurver i FAM- og HEX-kanalerne, og Ct-værdien er ≤40, kan det bedømmes, at prøven er positiv for den nye coronavirus fra 2019 (2019-nCoV).
7.3 Hvis testprøven kun har en tydelig amplifikationskurve i én kanal af FAM eller HEX, og Ct-værdien er ≤40, og der ikke er nogen amplifikationskurve i den anden kanal, skal resultaterne testes igen. Hvis resultaterne af den nye test er konsistente, kan prøven bedømmes som positiv for den nye
coronavirus 2019 (2019-nCoV). Hvis resultatet af den nye test er negativt, kan det bedømmes, at prøven er negativ for 2019 ny coronavirus (2019-nCoV).
Positiv vurderingsværdi
ROC-kurvemetoden bruges til at bestemme reference-CT-værdien for kittet, og den interne kontrolreferenceværdi er 40.
Fortolkning af testresultater
1. Hvert forsøg skal testes for negative og positive kontroller. Testresultater kan kun bestemmes, når kontrollerne opfylder kvalitetskontrolkravene.
2. Når FAM- og HEX-detektionskanalerne er positive, kan resultatet fra CY5-kanalen (intern kontrolkanal) være negativt på grund af systemkonkurrence.
3. Når det interne kontrolresultat er negativt, og reagensglassets FAM- og HEX-detektionskanaler også er negative, betyder det, at systemet er deaktiveret, eller at funktionen er forkert, og testen er ugyldig. Derfor skal prøverne testes igen.
